Keywords：原代肝細(xì)胞；Primary Hepatocytes; 肝細(xì)胞分離；肝細(xì)胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol；Isolation of Primary Hepatocytes

肝臟作為藥物暴露的主要器官，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細(xì)胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。

一、原代肝細(xì)胞分離方法

肝細(xì)胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細(xì)胞提取提取有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶消化法、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位膠原酶灌注法等。

【直接剪切法】

原理：將肝臟切成小塊，然后用膠原酶或胰蛋白酶進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，適用于大量細(xì)胞的分離。

缺點(diǎn)：細(xì)胞損傷較大，純度較低。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理：將肝臟切成小塊，在培養(yǎng)皿中加入含特定生長因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，使組織塊貼壁生長，然后逐漸分離得到肝細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣，細(xì)胞數(shù)量較少。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較為徹-底地分解細(xì)胞間物質(zhì)，獲得較純的肝細(xì)胞。

缺點(diǎn)：胰蛋白酶的價(jià)格較貴，成本較高。

【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中，使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)分開，然后收集分離得到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣，細(xì)胞數(shù)量較少。

【半原位膠原酶灌注法】

原理：將肝臟放置在特定裝置中，通過門靜脈灌注膠原酶溶液，使肝臟在生理狀態(tài)下進(jìn)行消化，然后收集分離得到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較為真實(shí)地模擬生理狀態(tài)，獲得的細(xì)胞形態(tài)、活性較好。

缺點(diǎn)：操作較為復(fù)雜，成本較高。

其中，兩步膠原酶灌流法因其對肝細(xì)胞損傷作用較小，肝細(xì)胞產(chǎn)率和存活率高，成為了分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法。

二、原代肝細(xì)胞分離流程

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，在兩步膠原酶灌注的基礎(chǔ)上，開發(fā)了原代肝細(xì)胞分離試劑盒，有標(biāo)準(zhǔn)的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其內(nèi)整合了包括灌流液、膠原酶、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞純化液、試驗(yàn)耗材等在內(nèi)的所有組分，可適用于大鼠、小鼠等多個(gè)種屬原代肝細(xì)胞的分離。以下為詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程：

1、實(shí)驗(yàn)材料

1)動(dòng)物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠

2)儀器：恒溫水浴鍋、水平離心機(jī)、移液器、生物安全柜

3)試劑：膠原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化終止液、分離液添加劑、肝細(xì)胞純化液

4)耗材：0.22um過濾器、20ml無菌注射器、10ml無菌注射器、5ml無菌注射器、無菌紗布、無菌剪刀、無菌鑷子、無菌燒杯、無菌擦手紙、無菌50mL離心管及巴氏吸管

2、試劑預(yù)處理

1)灌流溶液A：實(shí)驗(yàn)前37℃水浴預(yù)熱30分鐘。

2)灌流溶液B：實(shí)驗(yàn)前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶，充分溶解后用0.22µm過濾器過濾。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑，然后37℃水浴預(yù)熱30分鐘。

3)消化終止液：實(shí)驗(yàn)前在無菌條件下，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑，混勻后置于冰上備用。

3、實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果

(一)  肝臟獲取

1)盡可能于半分鐘內(nèi)將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進(jìn)行全身消毒，并轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。

2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開，以裸露腹部肌肉部位。

3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開，使肝臟充分暴露，注意不要將大鼠內(nèi)臟器官剪破。

(二)  組織處理

1)用剪刀剪開圖A所示位置，剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A，將每葉肝臟都灌注至土黃色。

2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B，直至肝臟軟爛。

(三)  細(xì)胞獲取

1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀，補(bǔ)加灌流溶液B至30mL.

2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌。

3)消化結(jié)束后按照混懸液與消化終止液1：1的比例加入消化終止液。

4)無菌紗布過濾即得肝細(xì)胞懸液。

(四)  細(xì)胞洗滌

1)將肝細(xì)胞懸液輕輕顛倒混勻，分裝至50mL離心管。

2)70g（升速 3、降速 3）、4℃離心 5min。

3)在超凈工作臺(tái)中棄上清，消化終止液重懸細(xì)胞沉淀。

(五)   細(xì)胞純化

1)按照 7：3 的比例（即細(xì)胞懸液：肝細(xì)胞純化液）加入肝細(xì)胞純化液并混勻。

2)100g（升速 3、降速 3）、4℃離心 10min。

3)棄上清，使用凍存液將細(xì)胞重懸，并于液氮罐中保存。

如圖所示，該圖為IPHASE技術(shù)人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細(xì)胞照片，經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活率在90%以上，且數(shù)量共有80million，說明以IPHASE原代肝細(xì)胞分離試劑盒為提取材料，可獲得純度高、活率好且數(shù)量多的新鮮原代肝細(xì)胞！

三、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，深刻識(shí)到原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞。因此，在兩步膠原酶灌注法的基礎(chǔ)上研發(fā)了原代肝細(xì)胞分離試劑盒，在標(biāo)準(zhǔn)的肝細(xì)胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進(jìn)行肝細(xì)胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細(xì)胞提取，并以SD大鼠為實(shí)例，證明該試劑盒、該方法具有實(shí)用性！除此以外，IPHASE以相似分離流程，研發(fā)、生產(chǎn)了多種屬、多規(guī)格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細(xì)胞，供客戶購買使用，為客戶縮短時(shí)間，節(jié)約成本！

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢：

合規(guī)性：生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰。

安全性：生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。

高質(zhì)量：生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。

可定制：可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬肝細(xì)胞的定制服務(wù)。

發(fā)    文    章    得    獎(jiǎng)    勵(lì)

凡使用本公司產(chǎn)品，在國內(nèi)及國際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內(nèi)），并注明產(chǎn)品屬于我司所有，即可申請獎(jiǎng)勵(lì)。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同，給予不同金額獎(jiǎng)品：

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